واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک روش برای ساخت سریع میلیون‌ها تا میلیاردها نسخه از یک نمونه DNA است. این روش به دانشمندان اجازه می‌دهد تا یک قطعه کوچک از DNA یا حتی بخشی از آن را تکثیر کنند. PCR در سال ۱۹۸۳ توسط کِری مولیس (که یک بیوشیمی‌دان بود) و همکارانش ابداع شد. مولیس و مایکل اسمیت (که روش‌های دیگری برای دستکاری DNA توسعه داد) در سال ۱۹۹۳ برای کارشان جایزه نوبل شیمی را دریافت کردند. امروزه این تکنیک کاربردهای گسترده‌ای در مراکز تحقیقاتی، آزمایشگاه‌های پزشکی، تجزیه و تحلیل قطعات DNA قدیمی و در پزشکی قانونی دارد.

تکنیک PCR دارای ۲ ماده اصلی است:

• پرایمر: یک قطعه کوتاه از دئوکسی‌ریبونوکلئوتید که به آن اولیگونکلئوتید نیز گفته می‌شود و مکمل بخشی از DNA مورد نظر است.
• آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت

کاربردهای PCR: این تکنیک برای تکثیر DNA جهت تعیین توالی، کلونینگ ژن و دستکاری، جهش‌زایی ژنی، ساخت فیلوژنی‌های مبتنی بر DNA یا تحلیل عملکرد ژن‌ها، تشخیص و پایش اختلالات ژنتیکی، تکثیر DNA قدیمی، تحلیل اثر انگشت ژنتیکی برای پروفایل DNA (به عنوان مثال در علوم جنایی و آزمایش‌های تعیین والد) و شناسایی عوامل بیماری‌زا در آزمایش‌های اسید نوکلئیک برای تشخیص بیماری‌های عفونی استفاده می‌شود.

یک تنظیم PCR پایه به چندین جزء و ماده نیاز دارد که شامل موارد زیر است:

• یک الگوی DNA که حاوی ناحیه هدف برای تکثیر است.
• DNA پلیمراز؛ آنزیمی که رشته‌های جدید DNA را پلیمریزه می‌کند؛ Taq پلیمراز مقاوم به حرارت به‌ویژه رایج است زیرا احتمال بیشتری دارد که در طی فرآیند دناتوراسیون DNA با دمای بالا سالم بماند.
• دو پرایمر DNA که مکمل انتهای ۳' رشته‌های حس و ضدحس DNA هدف هستند.
• دئوکسی‌نوکلئوزید تری‌فسفات‌ها (dNTPs) که بلوک‌های سازنده از آن‌ها DNA پلیمراز برای سنتز رشته جدید DNA استفاده می‌کند.
• محلول بافر که محیط شیمیایی مناسبی برای فعالیت بهینه و پایداری DNA پلیمراز فراهم می‌کند.
• کاتیون‌های دوظرفیتی، معمولاً یون‌های منیزیم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ Mg2+ رایج‌ترین است، اما Mn2+ می‌تواند برای جهش‌زایی DNA استفاده شود.

مراحل متداول در بیشتر روش‌های PCR به شرح زیر است:

1. شروع اولیه: این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی که نیاز به فعال‌سازی حرارتی دارند، ضروری است. معمولاً شامل گرم کردن محفظه واکنش به دمای ۹۴–۹۶ درجه سانتی‌گراد (۲۰۱–۲۰۵ درجه فارنهایت) است که بسته به نوع آنزیم ممکن است بالاتر نیز باشد.
2. دناتوراسیون: در این مرحله که اولین رویداد چرخه است، محفظه واکنش به دمای ۹۴–۹۸ درجه سانتی‌گراد (۲۰۱–۲۰۸ درجه فارنهایت) برای ۲۰–۳۰ ثانیه گرم می‌شود. این دما باعث شکستن پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل در DNA دو رشته‌ای و ایجاد دو رشته مجزا می‌شود.
3. اتصال پرایمرها: دمای واکنش به ۵۰–۶۵ درجه سانتی‌گراد (۱۲۲–۱۴۹ درجه فارنهایت) برای ۲۰–۴۰ ثانیه کاهش می‌یابد تا پرایمرها به هر یک از رشته‌های تک‌ رشته‌ای DNA متصل شوند. در این مرحله، پرایمرها که توالی‌های کوتاه و تک‌ رشته‌ای هستند، به ناحیه‌ای کوتاه در انتهای ۳' هر رشته متصل می‌شوند.

تشخیص دمای مناسب برای این مرحله بسیار حیاتی است زیرا کارایی و دقت واکنش به شدت تحت تأثیر دمای اتصال پرایمرها قرار دارد. این دما باید به اندازه کافی پایین باشد تا پرایمر به رشته متصل شود، اما به اندازه‌ای بالا باشد که این اتصال دقیقاً در ناحیه مکمل صورت گیرد. یعنی، پرایمر باید فقط به قسمتی از رشته که کاملاً مکمل است متصل شود و به هیچ قسمت دیگری وصل نشود. اگر دما بیش از حد پایین باشد، پرایمر ممکن است به‌طور ناقص متصل شود. اگر دما بیش از حد بالا باشد، پرایمر ممکن است اصلاً اتصال پیدا نکند. دمای معمول اتصال پرایمر حدود ۳ تا ۵ درجه سانتی‌گراد کمتر از دمای ذوب (Tm) پرایمرها است. پیوندهای هیدروژنی پایدار بین بازهای مکمل تنها زمانی تشکیل می‌شوند که توالی پرایمر با توالی الگو به‌طور بسیار دقیقی مطابقت داشته باشد. در این مرحله، آنزیم پلیمراز به هیبرید پرایمر-الگو متصل شده و سنتز DNA را آغاز می‌کند.

طولانی شدن/گسترش: دمای این مرحله به DNA پلیمراز مورد استفاده بستگی دارد؛ دمای بهینه برای فعالیت DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پلیمراز حدود ۷۵ تا ۸۰ درجه سانتی‌گراد (۱۶۷ تا ۱۷۶ درجه فارنهایت) است، اگرچه دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد (۱۶۲ درجه فارنهایت) معمولاً با این آنزیم استفاده می‌شود. در این مرحله، DNA پلیمراز یک رشته جدید DNA را که مکمل رشته الگوی DNA است، با افزودن dNTPهای آزاد از محلول واکنش در جهت ۵' به ۳' سنتز می‌کند. زمان دقیق مورد نیاز برای گسترش به طول ناحیه هدف DNA و DNA پلیمراز استفاده‌شده بستگی دارد. به‌طور کلی، در دمای بهینه، بیشتر DNA پلیمرازها حدود هزار باز در دقیقه پلیمریزه می‌کنند. در شرایط بهینه (یعنی اگر هیچ محدودیتی به دلیل مواد یا معرف‌های محدود نباشد)، در هر مرحله گسترش، تعداد رشته‌های هدف DNA دو برابر می‌شود. با هر چرخه متوالی، رشته‌های الگوی اصلی به همراه همه رشته‌های جدید تولیدشده، به‌عنوان الگو برای دور بعدی گسترش عمل می‌کنند که به تکثیر نمایی (هندسی) ناحیه هدف DNA منجر می‌شود.

فرآیندهای دناتوراسیون، اتصال پرایمرها و گسترش یک چرخه را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر ناحیه هدف DNA به میلیون‌ها نسخه، چرخه‌های متعددی لازم است. فرمولی که برای محاسبه تعداد نسخه‌های DNA پس از تعداد مشخصی از چرخه‌ها استفاده می‌شود، 2n است که n تعداد چرخه‌ها است. بنابراین، یک واکنش که برای ۳۰ چرخه تنظیم شده باشد، منجر به ۲^۳۰ یا ۱,۰۷۳,۷۴۱,۸۲۴ نسخه از ناحیه هدف دو رشته‌ای اصلی DNA می‌شود.

گسترش نهایی: این مرحله تکمیلی اختیاری است اما معمولاً در دمای ۷۰ تا ۷۴ درجه سانتی‌گراد (۱۵۸ تا ۱۶۵ درجه فارنهایت) (محدوده دمایی لازم برای فعالیت بهینه بیشتر پلیمرازهای مورد استفاده در PCR) به مدت ۵ تا ۱۵ دقیقه پس از آخرین چرخه PCR انجام می‌شود تا اطمینان حاصل شود که هر DNA تک رشته‌ای باقی‌مانده به‌طور کامل گسترش یافته است.

نگهداری نهایی: این مرحله نهایی محفظه واکنش را تا دمای ۴ تا ۱۵ درجه سانتی‌گراد (۳۹ تا ۵۹ درجه فارنهایت) سرد می‌کند و ممکن است برای نگهداری کوتاه‌مدت محصولات PCR مورد استفاده قرار گیرد.

دو روش برای اندازه‌گیری DNA تکثیر شده در PCR زمان واقعی وجود دارد:

روش اول: استفاده از نشانگرهای فلورسنت غیراختصاصی با استفاده از رنگی مانند SYBR® Green

در این روش، مشاهده هر توالی DNA دو رشته‌ای ممکن می‌شود. این روش نیازی به پروب ندارد و در نتیجه هزینه‌های تنظیم و اجرای اندازه‌گیری کاهش می‌یابد. همچنین، چندین رنگ می‌تواند به یک مولکول تکثیر شده متصل شود که حساسیت را برای تشخیص محصولات تکثیر شده افزایش می‌دهد.

در واکنش PCR زمان واقعی با SYBR Green، به یک الگو که حاوی توالی هدف مورد نظر است، به همراه پرایمرها یا قطعات کوچک DNA برای تکثیر، چهار باز تشکیل‌دهنده DNA یا dNTPها (dTTP، dATP، dCTP، dGTP) و آنزیم DNA پلیمراز مورد نیاز است. رنگ SYBR Green معمولاً در مخلوط واکنش که حاوی آنزیم DNA پلیمراز است، گنجانده می‌شود.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز زمان واقعی شامل مجموعه‌ای از چرخه‌های تکراری (معمولاً ۳۵ تا ۴۰ چرخه) است و هر یک از این چرخه‌ها شامل چهار مرحله توصیف‌شده در بالا است.

در این نوع روش، پس از گسترش، SYBR Green به همه مجتمع‌های DNA دو رشته‌ای تازه سنتز شده متصل می‌شود و نور فلورسنت ساطع می‌کند. با ادامه چرخه PCR، نور فلورسنت تجمع یافته و در پایان هر چرخه PCR اندازه‌گیری می‌شود.

روش دوم: استفاده از نشانگرهای فلورسنت اختصاصی با استفاده از پروب

PCR زمان واقعی مبتنی بر پروب امکان هیبریداسیون را فراهم می‌کند. خاص بودن پروب در PCR زمان واقعی منجر به پس‌زمینه کم و حذف نتایج مثبت کاذب می‌شود. همچنین می‌توانید پروب‌ها را با رنگ‌های مختلف و قابل تشخیص برچسب‌گذاری کنید تا امکان تکثیر دو توالی مجزا در یک لوله واکنش فراهم شود.

امروزه، شرکت‌های مختلفی در سراسر جهان دستگاه‌های PCR و لوازم جانبی آن را تولید و به فروش می‌رسانند. این دستگاه‌ها دارای ویژگی‌ها و دقت‌های مختلفی هستند. شرکت تیان‌لونگ چین تولیدکننده تجهیزات مولکولی از جمله دستگاه‌های ترموسایکلر PCR و مجموعه کامل لوازم PCR و لوازم جانبی آن‌ها است.

این دستگاه‌ها در مراکز تحقیقاتی و تشخیص پزشکی قابل استفاده هستند. شرکت وستا تجهیز پارت نماینده انحصاری فروش و خدمات پس از فروش این شرکت است. این شرکت با بهره‌گیری از کارشناسان مجرب همواره سعی در جلب رضایت متخصصان و پژوهشگران گرامی داشته است.