استخراج نوکلئیک اسیدها:

استخراج نوکلئیک اسید یا خالص سازی نوکلئیک اسید یک تکنیک ضروری، در زیست شناسی مولکولی است. این تکنیک شام ل جداسازی، خالص سازی و تغلیظ نوکلئیک اسیدها شامل DNA و RNA از نمونه­ های مختلف می­باشد.

اصول پایه استخراج نوکلئیک اسیدها شامل شکستن ساختار سلول­ها (مانند غشای سلولی، پوشش هسته یا دیواره سلولی) به روش فیزیکی و یا شیمیایی می­باشد. در نهایت مولکول­های آزاد شده خالص و تغلیظ می­گردند تا نمونه­ها نوکلئیک اسید با غلظت بالا به دست بیاید. نوکلئیک اسیدهای استخراج شده، نمونه ه­ای خوبی برای تست­های مختلفی چون PCR، Real Time PCR، توالی یابی ژنی و southern blot  می­باشند. هم­چنین در تشخیص عفونت­های ویروسی و باکتریایی نیز نقش مهمی دارد. امروزه این تکنیک در تشخیص بیماری کووید-19 از اهمیت بالایی برخوردار شده­است.

مراحل استخراج نوکلئیک اسیدها:

• تخریب سلولی (Cell distruption/ Lysis): در این مرحله بافر استخراج یا گرما باعث تخریب ساختارهای احاطه کننده نوکلئیک اسیدها می­شوند. این ساختارها شامل غشای سلولی و پوشش هسته می­باشند. بافر استخراج معمولا حاوی SDS به همراه آنزیم (به عنوان مثال پروتئین کیناز K)، یک عامل کلات کننده (EDTA) یا بافر تریس می­یاشد.
• جداسازی و خالص سازی (Separation and purification): در این مرحله ناخالصی ­ها از جمله لیپیدها و پروتئین­ ها پاکسازی می­ شود.
• تغلیظ و ته نشین سازی (Concentration and precipitation): پس از خالص سازی اولیه، هم­چنان ممکن است مقادیری از ناخالصی­ وجود داشته باشد. بنابراین روش­های مختلف ته نشین سازی مانند ته نشین کردن با الکل می­تواند برای خالص سازی و تخلیص بیش­ترنوکلئیک اسیدها بکار گرفته شود. در نتیجه این مرحله مولکول­های نوکلئیک اسید با غلظت بالاتری به دست می­آید.

روش­های استخراج نوکلئیک اسیدها:

جهت استخراج اسیدهای نوکلئیک، روش­های مختلفی وجود دارد. جهت انتخاب روش استخراج مناسب، باید عواملی مانند هدف استخراج، آنالیزهای بعدی، نوع اسیدهای نوکلئیک مورد نظر، ارگانیسم منشا و نوع نمونه را در نظر گرفت. به عنوان مثال، RNA مولکولی ناپایدار است، به همین جهت باید از نمونه­های تازه و روش­های عاری از RNase استفاده کرد. در استخراج RNA، به ویژه در نمونه­های گیاهی، حذف ناخالصی­ها اهمیت زیادی دارد. به همین جهت از موادی مانند ترایزول، کلروفرم و ایزوپروپانول جهت حذف لیپیدها، کربوهیدرات­ها، پروتئین­ها و DNA استفاده می­شود.

• استخراج به روش فاز جامد

بهترین روش برای استخراج نوکلئیک اسیدها در تعداد نمونه بالا:

استخراج فاز جامد (Solid-phase extraction) یا به اختصار SPE یک روش کارآمد برای استخراج نوکلئیک اسیدها است. در این روش، از نمونه­ های با حجم کم، نوکلئیک اسیدهای با خلوص و غلظت بالا به دست می­آید. نوکلئیک اسیدهای به دست آمده برای مقاصد مختلفی مناسب است. کیت­های مختلف شناسایی و استخراج نوکلئیک اسید در بازار موجود است. از آن­جا که در این روش اکثرا از سیلیکا به عنوان فاز جامد استفاده می­شود، به آن استخراج وابسته به سیلیکا هم گفته می­شود.

مراحل استخراج فاز جامد برای نوکلئیک اسیدها:

• تجزیه سلولی: به نمونه­ها بافر استخراج اضافه می­شود. این بافر، غشا و سایر ساختارهای سلولی را از بین می­برد.
• اتصال به نوکلئیک اسیدها: در این مرحله نوکلئیک اسیدها به فاز جامد متصل می­شوند و سایر مولکول­ها از ستون عبور کرده و در تیوب سانتریفیوژ جمع می­شوند تا در نهایت دور ریخته شوند.
• شستشو: از یک بافر شستشو جهت پاکسازی ناخالصی­ها استفاده می­شود.
• رها سازی: با استفاده از یک بافر رها ساز (مانند یک محلول هایپواسموتیک هم­چون آب، بافر TE، یا بافر Tris، نوکلئیک اسیدها ستون را رها کرده و در یک تیوب سانتریفیوژ تجمع میابند.

• استخراج به روش بستر مغناطیسی:

روش بستر مغناطیسی (Magnetic Bead Method) نوعی روش فاز جامد تغییر یافته است. این روش راهی مطمئن برای جداسازی DNA از پروتئین­ها و سایر ناخالصی­های موجود در نمونه است.

• استخراج به روش شیب چگالی سزیم کلرید 

روش شیب چگالی سزیم کلرید (Cesium Chloride Gradient Centrifugation) یکی از روش های شیمیایی استخراج اسیدهای نوکلئیک است؛ این روش از دهه 50 میلادی اساس کار تحقیقات بالینی قرار گرفت. اساس این تکنیک استقرار اسیدهای نوکلئیک در نوار اختصاصی خود در شیب چگالی سزیم کلرید است، در این روش محلول سزیم کلرید و عصاره سلولی به مدت چند ساعت سانتریفیوژ می شوند و در شیب چگالی به وجود آمده مولکول ها بر اساس چگالی شناوری ویژه خود جدا می شوند. پروتئین ها دانسیته کمتری دارند و  RNA و پلازمید های دارای سوپرکویل نسبت به DNA دارای دانسیته بیشتری هستند. در نهایت برای مشاهده باند DNA از اتیدیوم بروماید استفاده می شود. امروزه این روش در استخراج پلازمید کاربرد دارد. استخراج پلازمید ها از کشت باکتری مانند روش کلی خالص سازی DNA از سلول است؛ اما در استخراج پلازمید لازم است که DNA پلازمیدی از مقدار زیادی DNA باکتریایی موجود در سلول تفکیک شود. برای این منظور روش های مختلفی وجود دارد که یکی از آن ها شیب چگالی سزیم کلرید است.

• استخراج قلیایی

استخراج قلیایی (Alkaline Extraction)، روشی مناسب جهت استخراج DNA پلازمیدی است. الکل به کار گرفته شده در این روش، DNA کروموزومی را دناتوره کرده اما با پیوند کووالانسی به DNA پلازمیدی متصل می­شود. پس از خنثی سازی، DNA کروموزومی رسوب کرده و DNA پلازمیدی در فاز آبی باقی می­ماند.

• استخراج فنول- کلروفرم

در روش استخراج فنول- کلروفرم (phenol- Chloroform Extraction) که به آن استخراج تیوسیانات- فنول- کلروفرم (Thiocyanate- Phenol- Chloroform Extraction) نیز گفته می­شود، روشی مناسب جهت استخراج RNA است. در این روش پس از سانتریفیوژ کردن، RNA در فاز آبی (بالایی) و DNA و پروتئین­ها در فاز میانی و پایینی قرار می­گیرند.

• استخراج CTAB

در این روش از نوعی دترجنت به نام Cethyltrimethylammonium Bromide یا به اختصار CTAB استفاده می­شود. این روش برای استخراج اسیدهای نوکلئیک گیاهی کاربرد دارد. نمونه­های گیاهی سرشار از ناخالصی­ها و دبری­های مختلف می­باشند. CTAB با اسیدهای نوکلئیک کمپلکس تشکیل می­دهد و باعث رسوب آن­ها می­شود. در حالیکه به بقیه مواد موجود در عصاره سلولی متصل نمی­شود. رسوب حاصل با نمک شستشو داده می­شود و اسیدهای نوکلئیک با استفاده از الکل رسوب داده می­شوند.

• استفاده از ذرات Chelax

این روش در پزشکی قانونی و تحقیقات جنایی کاربرد دارد. در این روش از آثار به جا مانده در صحنه جرم مانند لکه خون و مو نمونه­برداری می­شود. این روش کمک می­کند که با وجود حجم اندک نمونه، DNA موجود برای انجام PCR حفظ شود. Chelax ذرات آنیونی مصنوعی هستند که به صورت جاذب یون­های چندظرفیتی مانند منیزیوم عمل می­­کنند. حذف این یون­ها باعث تخریب و غیرفعال شدن آنزیم­های هیدرولیز کننده DNA (DNase) می­شود.

امروزه کمپانی­های مختلفی در سرتاسر جهان به تولید و فروش دستگاه­های اتوماتیک استخراج  نوکلئیک اسیدها می­پردازند. این دستگاه­ها دارای امکانات و میزان دقت متفاوتی می­باشند. کمپانی تیانلان چین (Tianlong)، تولید کننده تجهیزات مولکولی از جمله دستگاه­های اتوماتیک استخراج نوکلئیک اسیدها و ملزومات آن­ها می­باشد. این دستگاه­ها قابلیت استفاده در مراکز تحقیقاتی و تشخیص طبی را دارا می­باشند. شرکت وستا تجهیز پارت نماینده انحصاری فروش و خدمات پس از فروش این کمپانی می­باشد. این شرکت با به کارگیری کارشناسان مجرب، همواره در جهت کسب رضایت متخصصین و محققین محترم تلاش کرده ­است.