الایزا

الایزا (ELISA) یک تکنیک آزمایشگاهی است که مواد خاص موجود در مایعات بدن را شناسایی می ­کند. متخصصین آزمایشگاهی از این تکنیک برای تست­ های مختلف بالینی مانند تشخیص عفونت و یا تست بارداری استفاده می­ کنند.

الایزا آنتی بادی­ ها، آنتی ژن­ ها، پروتئین­ ها و هورمون­ های خاص موجود در نمونه­ های مایع مانند خون، پلاسما، ادرار، بزاق و مایع مغزی-نخاعی (CSF) را شناسایی و اندازه ­گیری می­کند. الایزا مخفف "enzyme-linked immunosorbent assay" می­باشد. تست­های مختلف الایزا به شناسایی شرایط مختلفی کمک می­کند. مانند عفونت­های باکتریایی و ویروسی (مانند بیماری لایم و HIV) و شرایط غدد درون ریز مانند بیماری­ های تیروئید. تست ­های بارداری خانگی نیز مبتنی بر الایزا هستند. این تست­ها وجود هورمون بارداری (HCG) را شناسایی می­کنند.

تست­های ایمونواسی چیست؟

تست­های ایمونواسی (Immunoassays tests) تست­هایی هستند که مبتنی بر برهمکنش آنتی ژن-آنتی بادی (در شرایط آزمایشگاهی و نه درون بدن) هستند. آنتی بادی­ها موادی هستند که سیستم ایمنی بر علیه موادی خاص تولید می­کند. آنتی ژن­ها  هر نوع شناساگر یا مارکری هستند که آنتی بادی­ها می­توانند آن­ها را شناسایی کنند. آنتی ژن­ها معمولا از جنس پروتئین و یا قند هستند و بر روی سطح سلول­ها یا ویروس­ها وجود دارند. آنتی ژن­ها بر روی سطح سلول­های مختلفی هم­چون ویروس­ها، باکتری­ها، آلرژن­ها، انگل­ها، پروتئین­ها، سلول­های تومور و سلول­های طبیعی بدن وجود دارند. برای تست­های ایمونواسی متخصصین آزمایشگاهی از آنتی ژن­ها و آنتی بادی­های موجود در آزمایشگاه برای شناسایی وجود آنتی ژن­ها و آنتی بادی­های خاص در مایعات بدن استفاده می­کنند.

کاربردهای الایزا:

• اندازه گیری آنتی بادی بر علیه باکتری­ها و ویروس­ها. از عفونت­های باکتریایی قابل شناسایی با الایزا می­توان به بیماری لایم، بروسلوزیس و سفلیس، از عفونت­های ویروسی می­توان به HIV، هپاتیت A، B و C و از عفونت­های قارچی به کاندیدا اشاره نمود.
• اندازه گیری اتوآنتی بادی­ها: اتوآنتی بادی­ها، آنتی بادی­هایی هستند که سیستم ایمنی بر علیه سلول­های خودی تولید می­کند. و باعث بروز بیماری می گردند دیابت نوع I، مثالی از این بیماری­ها است. در این بیماری اتوآنتی بادی­ها با حمله به سلول­های انسولین ساز پانکراس، آن­ها را تخریب می­کنند.
• اندازه گیری سطح هورمون­های مختلف مانند هورمون بارداری، FSH و تستوسترون
• بررسی سلامت خون اهداکنندگان خون از نظر عفونت­های ویروسی مختلف مانند HIV.
• بررسی وجود یا عدم وجود مواد مخدر مانند امفتامین یا کوکائین
• اندازه گیری سطوح تومورمارکرها مانند PSA که تومورمارکر پروستات می­باشد.
• شناسایی آلرژن­ها

انواع الایزا:

• الایزای مستقیم (Direct ELISA): مراحل الایزا مستقیم به شرح زیر می­باشد:
• نمونه مورد نظر، به چاهک های میکروپلیت اضافه می شود و به آن فرصت داده می شود تا به سطح چاهک متصل شود.
• محلول یک پروتئین غیر واکنش دهنده مثل سرم آلبومین گاوی و یا کازئین به هر چاهک اضافه می شود تا به قسمت هایی از سطح چاهک ها که توسط آنتی ژن پوشیده نشده است متصل شود.
• یک محلول آنتی بادی اولیه اضافه می شود. این آنتی بادی به یک آنزیم کونژوگه شده است. این آنتی بادی اولیه، به طور اختصاصی به آنتی ژن های موجود در نمونه متصل می شود.
• به آنزیم مذکور، سوبسترا اضافه می شود. در اثر واکنش این سوبسترا با آنزیم، تغییر رنگ حاصل می شود.
• از طریق اسپکتوفتومتر می توان شدت رنگ حاصل را به طور کمی محاسبه نمود.

نتایج الایزا به طور کیفی و یا کمی بیان می شود. نتایج کیفی در قالب مثبت یا منفی بیان می شود که به ترتیب نشان دهنده وجود و یا عدم وجود ماده مورد نظر در نمونه است. در الایزای کمی، از ماده مورد نظر که قرار است تعیین غلظت شود، غلظت های مختلف ساخته می شود و منحنی استاندارد رسم می شود. چگالی نوری (OD) نمونه ها با منحنی استاندارد رسم شده مقایسه می شود و غلظت آنتی ژن مورد نظر محاسبه می شود.

• الایزای ساندویچ (Sandwich ELISA): مراحل این نوع از الایزا به شرح زیر می باشد:
• سطح چاهک ها با تعداد مشخصی آنتی بادی پوشیده می شود.
• هر محل اتصال غیر اختصاصی روی سطح بلوک می شود.
• نمونه حاوی آنتی ژن به چاهک ها اضافه شده و آنتی ژن ها به آنتی بادی ها متصل می شوند.
• جهت حذف آنتی ژن های باند نشده، پلیت شستشو داده می شود.
• آنتی بادی اولیه اضافه شده و به آنتی ژن متصل می شود.
• آنتی بادی های ثانویه که به آنزیم کونژوگه شده است، به عنوان آنتی بادی شناساگر اضافه می شود. این آنتی بادی به طور غیراختصاصی به ناحیه Fc آنتی بادی های اولیه متصل می شود.
• جهت حذف کمپلکس های آنتی بادی- آنزیم باند نشده به آنتی بادی اولیه، پلیت شستشو داده می شود.
• سوبسترای آنزیم اضافه می شود. در اثر واکنش حاصل، رنگ، فلوروسانس و یا سیگنال الکتروشیمیایی ایجاد می شود.
• جذب، فلوروسانس و یا سیگنال الکتروشیمیایی حاصل، اندازه گیری می شود. بدین ترتیب آنتی ژن مورد نظر، به طور کیفی و کمی بررسی می شود.

• الایزای رقابتی (Competitive ELISA): در ادامه به سومین نوع الایزا پرداخته شده است.
• آنتی بادی های غیر نشاندار، با آنتی ژن موجود در نمونه انکوبه می شوند.
• کمپلکس های آنتی بادی-آنتی ژن به پلیتی که سطح چاهک های آن با آنتی ژن پوشیده شده است، اضافه می شود.
• برای حذف آنتی بادی های متصل نشده، پلیت شستشو داده می شود. هر چه آنتی ژن نمونه بیش تر باشد، کمپلکس آنتی بادی- آنتی ژن بیش تری تشکیل می شود. در نتیجه آنتی بادی باند نشده کم تری وجود دارد که به آنتی ژن های سطح چاهک ها متصل شود. به همین دلیل به این روش، رقابتی گفته می شود.
• آنتی بادی ثانویه نشان دار شده با آنزیم، اضافه می شود.
• سوبسترای آنزیم اضافه می شود. و واکنش حاصل، رنگ و سیگنال فلوروسانس ایجاد می کند.
• برای جلوگیری از اشباع نهایی سیگنال، واکنش متوقف می شود.

برخی کیت های الایزای رقابتی، به جای آنتی بادی نشاندار شده با آنزیم، آنتی ژن نشاندار شده با آنزیم دارند. آنتی ژن نشاندار، بر سر اتصال به آنتی بادی اولیه، با آنتی ژن اولیه (موجود در نمونه) رقابت می کند. هر چه آنتی ژن کمتری در نمونه وجود داشته باشد، آنتی ژن نشاندار بیش تری در دیواره باقی می ماند و سیگنال حاصل قوی تر است. برای شناسایی آنتی بادی HIV، چاهک های پلیت با آنتی ژن HIV پوشانده می شود. ازدو آنتی بادی اختصاصی استفاده می شود. یکی کونژوگه با آنزیم و دیگری موجود در سرم (در صورت مثبت بودن سرم از نظر آنتی بادی) و بین 2 آنتی بادی بر سر اتصال به آنتی ژن، رقابت تجمعی صورت می گیرد و سیگنال قوی تری به دست می آید. سرم به این چاهک ها اضافه می شود و در دمای 37 درجه سانتی گراد، انکوبه می شود. سپس شستشو داده می شود. اگر آنتی بادی وجود داشته باشد، کمپلکس آنتی بادی-آنتی ژن تشکیل می شود و هیچ آنتی ژنی برای آنتی بادی خاص HIV نشاندار شده با آنزیم باقی نمی ماند. این آنتی بادی ها پس از اضافه شدن آزاد باقی می مانند و در حین شستشو حذف می شوند. سوبسترا اضافه می شود اما هیچ آنزیمی وجود ندارد که روی آن اثر بگذارد. عدم تغییر رنگ نشان دهنده نتیجه مثبت می باشد.

• الایزای غیر مستقیم (Indirect ELISA): چهارمین نوع الایزا از چاهک های سنتی استفاده نمی کند، بلکه آنتی ژن ها را در مایع آزمایش معلق می گذارد. مراحل این روش به شرح زیر می باشد:
• آنتی بادی بدون برچسب در حضور آنتی ژن آن انکوبه می شود (نمونه)
• یک دوره انکوباسیون کافی برای اتصال آنتی بادی ها به آنتی ژن ها فراهم می شود.
• سپس نمونه از ظرف Scavenger عبور داده می شود. این می تواند یک لوله آزمایش یا یک جریان از طریق کانال طراحی شده باشد. سطح ظرف یا کانال Scavenger دارای "آنتی ژن Scavenger" متصل به آن است. اینها می توانند با آنتی ژن اولیه یکسان و یا شبیه آن باشند که آنتی بادی های آزاد به آن متصل می شوند. ظرف Scavenger باید دارای سطح کافی و زمان کافی برای اتصال آنتی ژن های Scavenger به تمام آنتی بادی های وارد شده به نمونه باشد.
• نمونه ای که اکنون حاوی آنتی بادی های برچسب گذاری شده و متصل شده است، از طریق یک آشکارساز عبور داده می شود. این دستگاه می تواند فلوسیتومتر یا دستگاه دیگری باشد که تگ ها را روشن می کند و پاسخ را ثبت می کند.

این آزمایش به چندین آنتی ژن اجازه می دهد تا به طور همزمان برچسب گذاری و شمارش شوند. این اجازه می دهد تا گونه های خاصی از باکتری ها با دو (یا چند) برچسب رنگی مختلف شناسایی شوند. اگر هر دو تگ روی یک سلول وجود داشته باشد، آن سلول همان سویه خاص است. اگر فقط یکی حضور داشته باشد، این طور نیست. این نوع از الایزا، با پلیت میکروتیتر قابل انجام نیست و تجهیزات مورد نیاز معمولاً پیچیدگی کمتری دارند.

از آنجایی که ELISA می تواند برای ارزیابی وجود آنتی ژن یا وجود آنتی بادی در نمونه انجام شود، ابزار مفیدی برای تعیین غلظت آنتی بادی سرم (مانند آزمایش HIV یا ویروس نیل غربی است. همچنین کاربردهایی در صنایع غذایی در تشخیص آلرژن های غذایی بالقوه مانند شیر، بادام زمینی، گردو، بادام و تخم مرغ پیدا کرده است و به عنوان آزمایش خون سرولوژیکی برای بیماری سلیاک. ELISA همچنین می تواند در سم شناسی به عنوان یک غربالگری احتمالی سریع برای کلاس های خاصی از داروها استفاده شود.

ELISA اولین آزمایش غربالگری بود که به دلیل حساسیت بالای آن به طور گسترده برای HIV مورد استفاده قرار گرفت. در روش الایزا، سرم فرد 400 بار رقیق می شود و روی صفحه ای که آنتی ژن های HIV به آن متصل است، اعمال می شود. اگر آنتی بادی های HIV در سرم وجود داشته باشد، ممکن است به این آنتی ژن های HIV متصل شوند. سپس صفحه شسته می شود تا سایر اجزای سرم حذف شوند. سپس یک "آنتی بادی ثانویه" تهیه شده مخصوص - آنتی بادی که به آنتی بادی های دیگر متصل می شود - روی صفحه اعمال می شود و سپس شستشوی دیگری انجام می شود. این آنتی بادی ثانویه از نظر شیمیایی از قبل با یک آنزیم مرتبط است. بنابراین، صفحه حاوی آنزیم متناسب با مقدار آنتی بادی ثانویه متصل به صفحه خواهد بود. یک بستر برای آنزیم اعمال می شود و کاتالیز توسط آنزیم منجر به تغییر رنگ یا فلورسانس می شود. نتایج ELISA به عنوان یک عدد گزارش می شود. بحث برانگیزترین جنبه این تست تعیین نقطه "برش" بین نتیجه مثبت و منفی است.

آزمایش‌های الایزا برای تشخیص انواع بیماری‌ها مانند دنگی، مالاریا، بیماری شاگاس، بیماری جان، و غیره وجود دارد. آزمایشات الایزا نیز به طور گسترده برای تشخیص آزمایشگاهی در آزمایشگاه های پزشکی استفاده می شود. از الایزا هم چنین برای تشخیص آنتی بادی SARS-CoV-2 در نمونه خون نیز استفاده می شود. ELISA از سال 2023 روش اصلی تشخیص بیماری‌زای گیاهی در سراسر جهان است.