کنترل کیفی محیط های کشت
محیط‌های کشت و کنترل کیفی آنها نقش اساسی را در آزمایشگاه میکروب شناسی ایفا می‌کنند و بطور گسترده‌ای جهت جدا‌سازی ارگانیزم‌ها، تعیین سوش و آنتی‌بیوگرام میکروارگانیسم‌های بیماریزا بکار می‌روند. بسیاری از آزمایشگاه‌ها بطور روتین محیط‌های کشت مورد نیاز برای مصارف تشخیصی و تحقیقاتی را خودشان تهیه می‌نمایند. با این همه اطمینان از اینکه محیط‌های کشت، کیفیت خوب و نتایج مطلوبی داشته باشند بایستی در تهیه و مصرف محیط‌های کشت معیارهای زیر را در نظر گرفت:
مواد خام
کنترل کیفی محیط‌ها بطور مستقیم بستگی به کیفیت مواد خام مورد استفاده در تهیه آنها دارد. آب یکی از مهمترین مواردی است که در تهیه محیط‌های کشت بکار می‌رود. سه معیار مهم آب مورد استفاده در تهیه محیط‌های کشت شامل وجود یون‌های مس، قدرت هدایت الکتریکی وpH می‌باشد. در شرایط ایده‌آل نباید یون‌های مس در آب مورد استفاده جهت تهیه محیط‌های کشت وجود داشته باشد چون خاصیت مهار کنندگی برای میکروارگانیسمها را دارد. pH آب مورد استفاده بهتر است کمی اسیدی باشد ولی در هر حال نباید کمتر از ۵/۵ باشد.
پتری دیش:
کنترل کیفی پتری دیش‌های مورد استفاده در تهیه محیط نیز اهمیت دارد. معمولأ پتری دیش‌ها را با اتیلن اکساید و یا اشعه گاما استریل می‌کنند. در صورت استفاده از پتری دیش‌هایی که با اتیلن اکساید استریل شده باشند بایستی به روش کروماتوگرافی وجود یا بقایای این ماده بررسی شود. اتیلن اکساید دارای خاصیت مهار کنندگی برای میکروارگانیسمها می‌باشد.
استریل کردن محیط‌های کشت:
استریل کردن، یک مرحله اساسی در تهیه و کنترل کیفی محیط‌های کشت است. معمولأ برای استریل کردن محیط‌های کشت از اتوکلاو استفاده می‌کنند، با این همه ارتباط نزدیکی بین مدت زمان لازم جهت استریل کردن و حجم محیط وجود دارد. حرارت بیش از حد ممکن است منجر به تخریب محیط‌های کشت گردد.
بنابراین تنظیم دما و مدت زمان آن اهمیت ویژه‌ای دارد. در شرایط معمولی دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه برای استریل کردن یک لیتر محیط کشت کافی است. در صورتیکه حجم محیط کشت بیش از یک لیتر باشد ممکن است مدت زمان بیشتری لازم باشد.
کنترل کیفی پارامترهای فیزیکی:
محیط کشت‌های تهیه شده باید از لحاظ فیزیکی و ظاهری بررسی شوند. معیارهای ظاهری قابل بررسی شامل وجود حباب، حفره، ناصافی سطح محیط، ترک خوردگی و یخ زدگی می‌باشد. ضخامت محیط نیز اهمیت دارد. ضخامت محیط کشت در پلیت ۴ میلیمتر است.
نگهداری محیط‌های کشت تهیه شده:
طول عمر محیط‌های کشت بستگی به محتویات محیط کشت، نحوه نگهداری و انبار کردن آنها دارد. جهت رعایت کنترل کیفی، تمامی محیط‌های کشت باید دور از نور آفتاب نگهداری شوند. تابش نور به محیط‌های کشت موجب تشکیل مواد باکتریواستاتیک و باکتریوساید مانند پراکسیداز می‌گردد.
حداقل طول عمر پلیت‌های کشت در دمای ۴ درجه سانتیگراد یک هفته می‌باشد، ولی اگر در داخل کیسه‌های پلاستیکی بسته بندی شوند بطوریکه هوا داخل آنها نفوذ نکند ۴-۳ هفته قابل مصرف هستند. طول عمر محیط کشت‌های حاوی آنتی‌بیوتیک بستگی به پایداری آنتی‌بیوتیک موجود در آن دارد. در مجموع برای رعایت کنترل کیفی، محیط‌های حاوی آنتی‌بیوتیک را در عرض یک هفته باید مصرف کرد. از سوی دیگر با گذشت زمان اینگونه محیط‌های کشت رطوبت خود را از دست داده، بدلیل افزایش غلظت آنتی‌بیوتیک قدرت انتخابی آنها افزایش می‌یابد.
دمای پلیت‌ها را باید قبل از مصرف به دمای اتاق رساند. اگر پلیت محیط کشت بیش از ۸ ساعت در دمای اتاق باقی بماند برای مصرف مناسب نیست. محیط‌های کشت تهیه شده در لوله در مقایسه با محیط‌های کشت پلیتی عمر طولانی دارند. اگر این محیط‌های کشت تهیه شده در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند ۶-۳ ماه قابل مصرف می‌باشند.
اشکالات رایج در کنترل کیفی محیط‌های کشت
| اشکال | علت |
| نرم بودن آگار | حرارت بیش از حد، pH پایین که موجب هیدرولیز آگار می‌گردد. اشتباه در وزن کردن، مخلوط نکردن خوب و عدم حل شدن |
| pH نامناسب | استفاده از شیشه‌های قلیایی، آب ناخالص، حرارت بیش از حد، آلودگی شیمیایی، اندازه‌گیریpH در حرارت نامناسب، استفاده از pH متر استاندارد نشده و استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده |
| رنگ نامناسب | ناخالص بودن آب، استفاده از شیشه آلات کثیف، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده، حرارت دادن بیش از حد و pH نامناسب |
| تیره شدن محیط | حرارت دادن بیش از حد، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده |
| رشد ضعیف ارگانیسم | استفاده از آب و یا شیشه آلات آلوده، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده، توزین غلط و عدم بهم زدن کافی محیط و حرارت بیش از حد. |
| افتراق رنگی ضعیف محیط کشت با رشد میکروب‌ها | استفاده از آب و یا شیشه آلات آلوده، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده، توزین غلط و عدم بهم زدن کافی محیط و حرارت بیش از حد. |
نگهداری دیسک‌های آنتی بیوتیکی
- دیسک‌ها باید در دمای-۸ تا -۱۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
- تمامی دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی گروه بتالاکتام مانند پنی‌سیلین، آمپی‌سیلین، کربنی‌سیلین، تیکارسیلین، اگزاسیلین و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورین‌ها و… باید در فریزر نگهداری شوند و فقط می‌توان مقداری از آن را بر اساس کار روزانه آزمایشگاه حداکثر به مدت یک هفته در یخچال معمولی نگهداری نمود.
- دیسک‌ها باید در ظروف دارای درپوش محکم و حاوی مواد جاذب رطوبت نگهداری شوند.
- دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی باید یک تا دو ساعت قبل از استفاده از یخچال یا فریزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.
تست حساسیت
تست حساسیت با توجه به رشد نمونه و اهمیت ارگانیسم توسط روش نیمه مک فارلند یا روش استاندارد دیسک دیفیوژن کربی‌بایر انجام می‌شود.
نگهداری طولانی مدت
برای نگهداری سویه‌های باکتری و رعایت کنترل کیفی می‌توان از روش‌های طولانی و کوتاه مدت استفاده نمود.
بهترین روش‌های نگهداری طولانی مدت شامل لیوفیلیزاسیون (Freeze drying) و نگهداری در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد یا پایین‌تر (در دیپ‌فریز یا در نیتروژن مایع) می‌باشد.
در صورت عدم دسترسی به فریزر ۷۰- درجه می‌توان سویه‌های با رشد سریع را در فریزر ۲۰- درجه نیز نگهداری نمود. در این شرایط توجه به نکات زیر ضروری است:
سویه‌های سخت رشد مانند هموفیلوس آنفلوآنزا و نیسریا گنوره در این دما قابل نگهداری نمی‌باشند و باید در فریزر ۷۰- درجه نگهداری شوند.
روش دیگر استفاده از روغن معدنی در دمای اتاق می‌باشد که در این روش روغن معدنی (یا پارافین مایع) را در حرارت خشک (۱۷۰ درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت) استریل می‌نمایند و سپس میکروب مورد نظر را روی محیط کشت داده و بعد از بدست آوردن کشت کافی، روغن استریل را به مقدار cc 1 روی سطح محیط می‌ریزند.
کشت خون
بروز سپسیس در سراسر جهان دارای ابتلا و مرگ و میر در حال افزایشی است. آشکار سازی سریع و دقیق باکتریمی برای بهبود وضعیت بیمار ضروری است. مراقبین بهداشتی، پرستاران و احتمالاً بسیاری از کارکنان آزمایشگاهی آموزش لازم و کافی در تکنیک‌های صحیح کشت خون را فرا نگرفته‌اند. از دیرباز پزشکان و میکروبیولوژیست‌ها به اهمیت کشت خون بعنوان یکی از مهمترین تست‌های آزمایشگاهی برای تشخیص بیماری‌های مهلک پی برده بودند.
در سال‌های اخیر مشخص شده که کشت‌های خون آلوده شده (ورود و حضور یک پاتوژن از خارج از جریان خون) که منجر به نتایج مثبت کاذب می‌شوند شایع هستند. عدم رعایت کنترل کیفی کشت‌های خون آلوده شده حدود نصف و یا بیشتر از نیمی از موارد تمام کشت‌های خون مثبت را در بعضی مراکز به خود اختصاص می‌دهند و این مسئله هم موجب تحمیل هزینه‌های بسیار برای بیماران و نیز سیستم مراقبت بهداشتی و درمانی شده و همچنین باعث سردرگمی تکنیسین‌ها شده است.
کشت خون
دلائل متعددی وجود دارد که چرا کشت‌های خون غالباً آلوده می‌شوند.
اولین و مهمترین فاکتور در رعایت کنترل کیفی مربوط به نحوه‌ی نمونه‌گیری است که پرستار یا نمونه‌گیر از تکنیک مناسب آسپتیک استفاده نمی‌کند. مطالعات مختلف نشان می‌دهند که فلبوتومیست‌های آموزش‌دیده و یا تیم‌های کشت خون نسبت به سایرین دارای میزان کمتری از کشت‌های خون آلوده هستند.
فاکتور دوم مربوط به ماده‌ی آسپتیک به تنهائی است، تنتور ید و کلرهگزیدین گلوکونات (chlorhexidine gluconate) برای استریلیزاسیون پوست نسبت به یدوفورها مثل پوویدون ایوداین (povidone iodine) بسیار مؤثرتر هستند.
فاکتور سوم طریقه فراهم کردن نمونه‌ی خون برای کشت است. در سالیان اخیر تمایلی برای بدست آوردن نمونه از طریق کاتترهای داخل رگی و یا از طریق دستگاه‌های دیگر مثل پورت‌ها پدید آمده و کشت‌های خون بدست آمده از این طریق بیشتر از نمونه‌هائی که از طریق خونگیری از عروق محیطی صورت گرفته آلودگی نشان داده‌اند.
چهارمین علت سیستم‌های کشت خون مدرن و محیط‌های کشتی است که در آنها از رزین‌های باند شده به آنتی‌بیوتیک و یا ذغال فعال استفاده می‌کنند. این سیستم‌ها اگرچه پاتوژن‌های بیشتری را آشکار می‌کنند اما از طرف دیگر استافیلوکوک‌های کوآگولاز منفی را بعنوان شایع‌ترین آلوده‌کننده‌ی کشت خون افزایش داده‌اند.
برای کشت خون معمولاً یک ست نمونه به بطری کشت هوازی و دیگری به بطری کشت غیرهوازی اضافه می‌شود. نخست نمونه را با سرنگ به بطری بیهوازی اضافه کرده و چنانچه حباب هوا در سرنگ باشد ابتدا به بطری هوازی خون اضافه می‌شود. مقدار خون دریافتی لازم از بزرگسالان ۱۰ الی ۲۰ میلی‌لیتر می‌باشد.
از کودکان و نوزادان ۱ الی ۵ میلی‌لیتر خون دریافت می‌شود. محیط‌های کشت خون در داخل بطری‌های آئروفیلیک و بیهوازی توسط شرکت‌های مختلف تولید می‌شوند. مقدار تلقیح نمونه خون باید به نسبت یک به پنج تا یک به ده در نظر گرفته شود.
آلوده کننده‌های کشت های خون و موارد موثر در کنترل کیفی آن:
با ضدعفونی کردن محل خونگیری، رعایت کامل شرایط سترونی و استاندارد در موقع خونگیری و تلقیح مستقیم خون به داخل بطری کشت خون می‌توان تا حد زیادی از آلوده شدن کشت‌های خون جلوگیری نمود، هر چند حتی با رعایت این موازین و در بهترین شرایط کاری حدود ۳% تا ۵% کشت‌های خون در معرض آلودگی قرار می‌گیرند.
این آلودگی می‌تواند منشأ پوستی یا محیطی داشته باشد. با این حال، چنین ارگانیسم‌هایی گاهی به عنوان عامل بیماریزای واقعی عمل نموده و می‌توانند موجب اندوکاردیت شوند. در این صورت کنترل کیفی رد است. شرایطی که یک عفونت واقعی را ترسیم می‌کنند بدین شرح است:
- اگر یک ارگانیسم در هر دو بطری کشت رشد نماید.
- اگر همان ارگانیسم در محیط‌های کشتی که با بیش از یک نمونه بیمار کشت مجدد شده باشد، رشد نماید.
- اگر رشد سریع باشد (در عرض ۴۸ ساعت)
- اگر ایزوله‌های مختلف یک گونه عیناً همان الگوی بیوتیپ و حساسیت دارویی را نشان دهند.
احتیاط‌های ایمنی در کنترل کیفی محیط کشت خون:
برای اجتناب از بروز عفونت نباید از یک محل دو بار اقدام به خونگیری شود. در مورد خون اخذ شده از بیماران مبتلا به عفونت‌های جدی (هپاتیت و ایدز) هنگام تزریق خون به درون شیشه‌های کشت خون باید دقت نمود تا سرسوزن در دست فرد خونگیر فرو نرود. سر‌سوزن‌های استفاده شده بدون گذاشتن درپوش آن، در ظروف خاص قرار داده می‌شود.
زمان نمونه‌گیری:
خونگیری از بیمار حتی‌المقدور قبل از تجویز آنتی‌بیوتیک باید انجام گیرد، گرچه بهترین زمان خونگیری دقیقاً قبل از شروع تب و لرز بیمار است، ولی آنچه که مهم است حجم خون کافی برای کشت است. توصیه می‌شود ۲ تا ۳ نمونه خون به فاصله یک ساعت از بیمار گرفته و کشت داده شود.
خونگیری بیش از ۳ بار ندرتاً لازم می‌شود. اگر فرصت کافی قبل از شروع درمان وجود نداشته باشد از دو ناحیه بطور جداگانه مقدار ۳۰ میلی‌لیتر خونگیری انجام می‌گیرد. در موارد تب با علت ناشناخته FUO، انجام ۴ کشت خون جداگانه (در دو روز و هر روز ۲ کشت) می‌تواند اکثر عوامل بیماریزا را مشخص سازد.
نگهداری و انتقال:
انتقال نمونه خون در عرض ۲ ساعت در حرارت اتاق انجام می‌گیرد. در صورتی که تأخیر بین گرفتن نمونه و کشت بیشتر باشد باید نمونه در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد گذاشته شود. شیشه‌های کشت خون تلقیح شده نبایستی در یخچال نگهداری شود. محیط‌های کشت خون تهیه شده بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شده و در انکوباتور (گرمخانه) قرار داده می‌شود.
