ELISA یک روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است که امکان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به صورت همزمان فراهم میکند. این روش در ایمونولوژی (ایمنی شناسی) برای تشخیص وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می شود که عموماً به عنوان ابزاری تشخیصی در پزشکی و پاتولوژی و همچنین تست کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع کاربرد دارد.
این آزمایش به منظور پی بردن به آنتی ژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن یا مواد غیرنرمالی که معرف برخی بیماری هاست انجام می شود. همچنین آنتی بادی هایی که در پاسخ به برخی عفونت ها یا بیماری ها به جود آمده نیز توسط این آزمایش قابل تشخیص هستند.
پیش از ایجاد روش الایزا تنها گزینه برای انجام سنجش ایمنی و سنجش های ایمونوشیمی، روش Radioimmunoassay بود. تکنیکی که در آن از آنتی ژن یا آنتی بادی نشاندار شده با مواد رادیواکتیو استفاده می شود. در این روش، ماده رادیواکتیو، سیگنالی تولید می کند که نشان می دهد آنتی ژن یا آنتی بادی خاص در نمونه وجود دارد یا نه؛ اما ازآنجایی که رادیواکتیویته تهدیدی برای سلامتی محسوب می شود به دنبال جایگزین ایمن تری برای آن بودند که به جای سیگنال رادیواکتیو، سیگنالی غیررادیواکتیو تولید کند. دو محقق به نام های G.B.Pierc و Stratis Avrameas مشاهده نمودند که زمانی که آنزیمی مثل پراکسیداز (Peroxidase) با سوبسترای مناسب واکنش می دهد، تغییر رنگی روی می دهد که از آن می توان به عنوان سیگنالی برای تعیین وجود آنتی بادی یا آنتیژن استفاده نمود. سرانجام در سال ۱۹۷۱ دو دانشمند سوئدی به نامهای Peter Perlmann و Eva Engval به روش الایزا به شیوه ی امروزی پی بردند.
مزایای استفاده از روش الایزا نسبت به روش های رادیواکتیو به قرار زیر است
• نداشتن خطرات مواد رادیواکتیوی
• طولانی بودن نیم عمر فعالیت آنزیم ها نسبت به مواد رادیواکتیو
• ارزان بودن تجهیزات و دستگاههای الایزا نسبت به دستگاه سنجش مواد رادیواکتیو
• آماده سازی آسان آزمایش الایزا و بی خطر بودن دفع ضایعات آن نسبت به مواد رادیواکتیو
معایب این روش
بدیهی است که هر روشی از نقاط ضعف و قوت خاص خود برخوردار است. ایرادهایی به سیستم آنزیمی وارد است که مهمترین آن مربوط به شرایط نگهداری کیت ها و عدم آلودگی آنها می باشد. برای شرح روش الایزا ابتدا نیاز به آشنایی با اصطلاحات زیر است:
•آنتی ژن: آنتی ژن ماده ای است که قادر است پاسخ ایمنی بدن را تحریک کند. پروتئین ها و گلیکوپروتنین ها (Glycoprotein) بهترین نمونه آنتی ژن ها هستند.
• آنتی بادی: آنتی بادیها ساختمانی خاص دارند و در ساده ترین حالت به شکل یک مولکول، با سه بازو دیده می شوند این مولکول را می توان به شکل Y در نظر گرفت. پایه Y در برقراری ارتباط آنتی بادی با سلول های سیستم ایمنی ایفای نقش می کند (FC).
دو بازوی دیگر این مولکول دقیقاً به هم شبیه بوده و بخش انتهایی برای هر آنتی ژن اختصاصی است. این قسمت که قادر است به یک دترمینانت آنتی ژنیک متصل شود، قطعه آنتی بادی و یا Fab نامیده می شود و به صورت کاملاً اختصاصی به اپی توپهای مشابهی بر سطح یک آنتی ژن یا دو آنتی ژن مشابه کنار هم می چسبد.
به طور معمول بر روی هر آنتی ژن، اپی توپ های متعددی وجود دارد، لذا علیه هر آنتی ژن، معمولاً تعداد زیادی آنتی بادی تولید می شوند که هرکدام مختص یک نوع اپی توپ است .
ذکر این نکته حائز اهمیت است که مثلاً در پی ورود میکروب ها به بدن، آنتی بادی ضد آنها تولید می شود، لذا یافتن آنتی ژن میکروب یا حتی آنتی بادی ضد این آنتی ژن، نشانگر حضور فعلی یا حضور قبلی میکروب در بدن است. میزان آنتی بادی ها در مراحل مختلف بیماری کم یا زیاد می شود، لذا مقدار آنتی بادی یا آنتی ژن نیز بسیار حائز اهمیت است. هنگامی که یک محلول حاوی آنتی ژن با محلول حاوی مقدار مناسب آنتی بادی مخلوط می شود، اغلب کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی رسوب می کند و یک توده نامحلول تشکیل می شود. اگر یک آنتی ژن به صورت جامد باشد، مانند یک سلول در قسمتی از یک بافت، این آنتی ژن می تواند با آنتی بادی در یک محلول متصل شود.
تجهیزات لازم برای انجام آزمایش الایزا
در آزمایش های پزشکی برای انجام آزمایشات سنجش ایمنی به روش الایزا امکانات زیر مورد نیاز است:
میکروپلیت ریدر
میکروپلیت واشر
سمپلر و عوامل پیپت کردن
انکوباتور برای انکوبه کردن پلیت ها
کیت الایزا
چگونگی انجام آزمایش الایزا
پایه اساسی آزمایش الایزا واکنش آنتی بادی با آنتی ژن می باشد. در این روش الایزا آنتی بادی اختصاصی با یک آتی ژن مشخص واکنش می دهد و سپس به آن، یک آنتی بادی اتصال یافته با یک آنزیم به عنوان سیستم نشانگر اضافه می شود. در ادامه با افزودن سوبسترای آنزیم آن را تبدیل به یک محصول که یک ماده رنگی می باشد نموده و توسط دستگاه قرائت می کنیم. طول موج رنگ به دست آمده که نشان دهنده وجود یک آنتی بادی (ویا آنتی ژن) و نیز غلظت آن می باشد توسط دستگاه الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا (فتومتر) قرائت شده و ثبت می گردد. لازم به ذکر است که آنتی بادی اختصاصی هر آنتی ژنی می بایست با روش های خاصی تولید شوند. برای نمونه، برای به دست آوردن آنتی بادی هر یک از ویروس های مشکوک به عامل بیماری زا می بایست آن ویروس را خالص سازی کرد وبرای این کار با تزریق ویروس به حیواناتی چون موش، بز و اسب آنتی بادی ای را که این حیوانات علیه آنتی ژن تزریقی می سازند، به کمک سانتریفیوژ استخراج نمود.
مراحل یک آزمون الایزا
مراحل انجام یک آزمون الایزا به صورت زیر است:
- جذب یک آنتی ژن یا آنتی بادی به سطوح جامد پلاستیکی که اصطلاحا پوشش دهی نامیده میشود.
- افزودن نمونه های مورد آزمایش
- انکوباسیون واکنش گرها برای در اختیار قرار دادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش
- خاتمه دادن واکنش انزیمی توسط متوقف کننده ها و قرائت دانسیته ی نوری بدست آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر
فاز جامد الایزا
امروزه بیشتر از پلیت های ۹۶ خانه ای به عنوان فاز جامد استفاده می شود. انواع انعطاف پذیر و جداشدنی از پلی وینیل کلراید و انواع سخت و محکم از پلی استیرن ساخته می شوند. هم اکنون شرکت های معتبر و متعددی به ساخت انواع مختلف پلیت های الایزا مشغول هستند. در برخی از انواع این پلیت ها، کف چاهک ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می باشند.
بعضی از پلیت ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می باشند. امروزه آزمایش های متعددی با موفقیت با هرکدام از این نوع پلیت ها انجام می شود و نمی توان گفت که قطعا کدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت دارد. می توان با انجام دو آزمایش الایزای کاملا یکسان که تنها در نوع پلیت متفاوت هستند و بررسی نتایج تشخیص داد که برای کدام نوع از انتی ژن، کدام پلیت بهتر است. به طور کلی پلیت هایی که انتهای چاهک های آنها تخت می باشد، توصیه میشود.
پوشش دهی در الایزا
از لحاظ تئوری بهترین بافری که مورد استفاده قرار میگیرد، بافری است که دارای pH برابر با ۱ تا ۲ واحد بالاتر از PH پروتئین اتصالی باشد؛ اما در عمل اندازه گیری آن آسان نیست چرا که پروتئین آنتی ژن( اتصال حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت است) .فرضا با انجام چند آزمایش الایزا که دارای pH متفاوت باشند و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش دهی داشته باشند، میتوان اتصال بهتر و مناسبتر پروتئین به پلیت را به دست آورد. پروتئین های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یک pH پائین تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه بین پروتئین و پلیت دارند.
گاهی اوقات بعضی از آنتی ژنها مشکلاتی را در پوششدهی بوجود میآورند؛ این آنتی ژنها شامل پلی ساکاریدها، لیپوپلی ساکاریدها و گلیکولیپیدها هستند که پوشش دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می نمایند. در اینگونه موارد یک پوشش دهی ابتدایی موردنیاز است که با یک آنتی سرم اختصاصی انجام می شود که یک حالت ساندویچی را بوجود می آورد، بنابراین مخلوط تخلیص نشده آنتی ژنها، مناسب برای پوشش دهی مستقیم نیست و در صورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده میشود.
به دلیل ماهیت غیرکووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جدا شدن یک پروتئین از پلیت نیز ممکن است رخ دهد، اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد، تأثیر مهمی در یک آزمون الایزا نخواهد گذاشت. انواع روشهای مختلف الایزا عبارتند از ساندویچی، رقابتی و غیررقابتی که در ادامه به آن می پردازیم.
