اصول الایزا (۲)

دستگاه الایزا

دستگاه الایزا در واقع شبیه دستگاه فتومتر می باشد، با این تفاوت که نوع کووِت (Covette) یا همان  ظرف محتوی نمونه، مسیر خوانش و تعداد فیلترها تغییر نموده است، به عنوان مثال به جای کووِت از چاهک یا Well استفاده شده و مسیر خوانش آن نیز برخلاف تکنیک های فتومتری، به صورت عمودی می باشد. همچنین با توجه به اینکه در تکنیک الایزا از آنزیم ها و سوبستراهای مشخصی استفاده می شود، لذا دارای فیلترهای کمتری نسبت به فتومترها می باشد.

تجهیزات لازم برای انجام آزمایش الایزا

در آزمایش های پزشکی برای انجام آزمایشات سنجش ایمنی به روش الایزا امکانات زیر مورد نیاز است:

1. میکروپلیت ریدر
2. میکروپلیت واشر
3. سمپلر و عوامل پیپت کردن
4. انکوباتور برای انکوبه کردن پلیت ها
5. کیت الایزا

کیت الایزا خود متشکل از مواد زیر است:

• یک یا دو عدد پلیت ۹۶ خانه ای که در ۱۲ ستون ۸ خانه ای قرار گرفته اند. هر یک از خانه ها را چاهک و هر ستون ۸ خانه ای را یک استریپ می گویند. جنس چاهک ها از پلی استیرن، پلی وینیل کلراید و یا پلی پروپیلن بوده و عمقی حدود یک سانتی متر داشته و به اشکال ته صاف و یا ته گرد موجود می باشند. چاهک های ته صاف برای قرائت اسپکتوفتومتری در سنجش هایی که افزایش رنگ دارند مناسب بوده و چاهک های ته گرد برای این امر مناسب نمی باشند.
• ویال های استاندارد کنترل منفی و مثبت: این ویال ها با توجه به نوع کیت می توانند به صورت محلول یا لیوفیلیزه باشند.
• رقیق کننده نمونه: مزیت رقیق کننده در این است که با توجه به رقیق سازی نمونه، اثر هوک را تا حد زیادی خنثی می نمایند. منظور از اثر هوک، کسب نتایج منفی کاذب به علت غلظت بالای آنالیت (Analyte) می باشد.
• کنژوگه نشان دار شده با آنزیم: مهم ترین آنزیم های مورد استفاده در الایزا شامل: پراکسیدآز، آلکالن فسفاتاز و پنی سلیناز می باشند ولی عمدتا از پراکسیدآز استفاده می شود. آلکان فسفاتاز به دلیل قیمت بالایی که نسبت به پراکسیداز دارد بیشتر در کارهای تحقیقاتی استفاده می شود. لازم به ذکر است نقش آنزیم مورد استفاده برای نشان دارسازی، در تعیین نوع سوبسترا و نوع محلول متوقف کننده بسیار مهم است.
• محلول شستشو: این محلول متشکل از بافر فسفات سالین phosphate buffer saline، Tween 20، و تایمرسال thimerosal میباشد. هرچند بافر فسفات سالین با تنظیم قدرت یونی و PH مناسب، اتصال غیراختصاصی به جداره چاهک را به حداقل می رساند، برای افزایش دقت و کاهش بیشتر اتصالات غیراختصاصی از مقدار کمی پروتئین و دترجنت مانند تواین ۲۰ استفاده می شود. از آنجایی که محیط های بافری غالبا برای رشد میکرواورگانیسم ها بسیار مناسب می باشند، لذا از ترکیبات نگهدارنده نظیر تایمرسال استفاده می شود.
• محلول سوبسترا-کروموژن: این محلول جداگانه یا به صورت ترکیبی موجود می باشد. سوبسترا بر اساس حلالیت می تواند محلول یا غیر محلول باشد اما سوبسترای مصرفی در آزمایش الایزا بایستی محلول باشد نوع سوبسترا بستگی به کونژوگه آنزیمی دارد، یعنی اگر کونژوگه آنزیمی پراکسیداز باشد، سوبسترا می تواند تترامتیل بنزیدین(TetraMethylBenzidine) و یا ارتوفنل دی آمین(Ortho phenylenediamine) باشد و رنگ حاصل از واکنش آبی خواهد بود. اگر کونژوگه آنزیمی آلکان فسفاتاز باشد، سوبسترا می تواند پارانیتروفنل (Para NitroPhenol) باشد و رنگ حاصل از واکنش زرد خواهد بود.
• محلول متوقف کننده یا بلوکر (stopping or Blocking Solution) : این محلول با توجه به نوع کونژوگه آنزیمی میتواند اسیدی یا قلیایی باشد. هنگامی که کنژوگه آنزیم پراکسیداز باشد، برای توقف واکنش می بایست از محلول های اسیدی نظیر اسید کلریدریک و یا اسید سولفوریک استفاده نمود. در این صورت رنگ آبی واکنش تبدیل به زرد می شود و اگر کونژوگه الکان فسفاتاز باشد برای توقف واکنش از محلول های قلیایی نظیر هیدروکسید سدیم، NaOH استفاده می شود که در این حالت رنگ زرد واکنش به رنگ قهوه ای تبدیل خواهد شد.

چگونگی انجام آزمایش الایزا

پایه اساسی آزمایش الایزا واکنش آنتی بادی با آنتی ژن می باشد. در این روش الایزا آنتی بادی اختصاصی با یک آتی ژن مشخص واکنش می دهد و سپس به آن، یک آنتی بادی اتصال یافته با یک آنزیم به عنوان سیستم نشانگر اضافه می شود. در ادامه با افزودن سوبسترای آنزیم آن را تبدیل به یک محصول که یک ماده رنگی می باشد نموده و توسط دستگاه قرائت می کنیم. طول موج رنگ به دست آمده که نشان دهنده وجود یک آنتی بادی (ویا آنتی ژن) و نیز غلظت آن می باشد توسط دستگاه الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا (فتومتر) قرائت شده و ثبت می گردد. لازم به ذکر است که آنتی بادی اختصاصی هر آنتی ژنی می بایست با روش های خاصی تولید شوند. برای نمونه، برای به دست آوردن آنتی بادی هر یک از ویروس های مشکوک به عامل بیماری زا می بایست آن ویروس را خالص سازی کرد وبرای این کار با تزریق ویروس به حیواناتی چون موش، بز و اسب آنتی بادی ای را که این حیوانات علیه آنتی ژن تزریقی می سازند، به کمک سانتریفیوژ استخراج نمود.

مراحل یک آزمون الایزا

مراحل انجام یک آزمون الایزا به صورت زیر است:

1. جذب یک آنتی ژن یا آنتی بادی به سطوح جامد پلاستیکی که اصطلاحا پوشش دهی نامیده میشود.
2. افزودن نمونه های مورد آزمایش
3. انکوباسیون واکنش گرها برای در اختیار قرار دادن مدت زمان کافی برای انجام واکنش
4. خاتمه دادن واکنش انزیمی توسط متوقف کننده ها و قرائت دانسیته ی نوری بدست آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر

فاز جامد الایزا

امروزه بیشتر از پلیت های ۹۶ خانه ای به عنوان فاز جامد استفاده می شود. انواع انعطاف پذیر و جداشدنی از پلی وینیل کلراید و انواع سخت و محکم از پلی استیرن ساخته می شوند. هم اکنون شرکت های معتبر و متعددی به ساخت انواع مختلف پلیت های الایزا مشغول هستند. در برخی از انواع این پلیت ها، کف چاهک ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می باشند.

بعضی از پلیت ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می باشند. امروزه آزمایش های متعددی با موفقیت با هرکدام از این نوع پلیت ها انجام می شود و نمی توان گفت که قطعا کدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت دارد. می توان با انجام دو آزمایش الایزای  کاملا یکسان که تنها در نوع پلیت متفاوت هستند و بررسی نتایج تشخیص داد که برای کدام نوع از انتی ژن، کدام پلیت بهتر است. به طور کلی پلیت هایی که انتهای چاهک های آنها تخت می باشد، توصیه میشود.

پوشش دهی در الایزا

این مرحله که یکی از مهم ترین مراحل آزمون الایزا می باشد، عبارت است از اتصال پروتئین آنتی ژن یا آنتی بادی بر روی پلیت، درون چاهک های یک پلیت ۹۶ خانه ای که عمدتا بر اساس واکنش های آب گریز مابین ماتریکس پلاستیکی و پروتئین می باشد، بنابراین هر پروتئین یک ثابت اتصال متفاوتی با پلیت دارد. این واکنش بستگی به بار خالص پروتئین ندارد. عمل پوشش دهی به عواملی مثل مدت زمان پوشش دهی، دما، غلظت پروتئین هایی که باید پوشش داده شوند، نسبت سطح چاهک ها به حجم محلول پوشش دهی و ضریب انتشار ملکول های پروتئینی درون محلول پوشش دهی درون چاهک ها بستگی دارد.

عوامل فوق یکپارچه بوده و جدای از یکدیگر نیستند. یکی از مهم ترین موارد، بدست آوردن غلظت مناسب از پروئتین برای اتصال مناسب به پلیت می باشد که از طریق تیتراسیون پروتئین به دست می آید. غلظت یک پروتئین جهت پوشش دهی، وابسته به فعالیت ان پروتئین می باشد. مشخص است که یک محلول پروتئینی که دارای مقدار کمی از پروتئین مورد نظر باشد، مقدار اتصال آن پروتئین به پلیت برر طبق نسبت حضور آن پروتئین در محلول کم می باشد و ناخالصی های موجود در محلول پروتئینی سطوحی را که باید پروتئین مورد نظر در اختیار داشته باشد، اشغال می نمایند که در نهایت منجر به یک اندازه گیری ضعیف می شود.

با استفاده از چند تست الایزا که در آنها غلظت پروتئین مورد نظر برای پوشش دهی متفاوت است می توان به یک غلظت مناسب از پروتئین جهت پوشش دست یافت. توجه به این مطلب مهم است که دانسیته اتصال پروتئین به پلیت در نتیجه نهایی اهمیت دارد. اتصال با دانسیته بالا حتی ممکن است برخلاف انتظار به نتایج ضعیف منجر شود، چرا که این دانسیته بالا میتواند از لحاظ قضایی اجازه نزدیک شدن پروتئین دوم (آنتی ژن یا آنتی بادی) را به پروتئین پوشش داده شده ندهند. در حقیقت ملکول های پروتئین پوشش داده شده، آنقدر با شدت و استحکام بالا (و بینابین یکدیگر) به سطح چاهک متصل شده اند که حتی جایگاه های اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئین دوم (فرضا آنتی بادی) نمی باشد.

غلظت های زیاد پروتئینی که باید پوشش داده شود، نیز منجر به همین مساله می شود. رابطه غلظت یک آنتی ژن یا آنتی بادی با چگالی نوری (optical density) به دست آمده در مرحله نهایی تست الایزا یک رابطه خطی صرف نیست و برای هر پروتئینی بسته به شکل فضایی آن پروتئین و نیز در هر محدوده میزان هیدروفوبیسیته (hydrophobicity) واکنش پروتئین – پلیت وابسته به دما نیز هست. افزایش دما موجب افزایش این هیدروفوبیسیته می شود و این افزایش منجر به اتصال مستحکم تر پروتئین به پلیت می گردد.

یکی از رایج ترین روش های پوشش دهی از لحاظ دما، در مجاورت قرار دادن پلیت با پروتئین در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد می باشد که در این دما بین ۱ تا ۳ ساعت زمان مناسبی برای اغلب پروتئین ها است. در مرتبه بعد می توان روش پوشش دهی در طول شب در ۴ درجه و یا ترکیبی از این دو را به کار گرفت.

البته مشخص است که افزایش دما در مدت زمان طولانی ممکن است باعث تغییراتی در ساختار پروتئین مورد نظر جهت اتصال به پلیت شوئ. تکان دادن یکنواخت، آرام و منظم پلیت نیز می تواند با افزایش میزان برخورد و در نتیجه اتصال پروتئین به پلیت، زمان مورد نظر برای پوشش دهی را کاهش داد.

بافر پوشش‌دهی

از لحاظ تئوری بهترین بافری که مورد استفاده قرار میگیرد، بافری است که دارای pH برابر با ۱ تا ۲ واحد بالاتر از PH پروتئین اتصالی باشد؛ اما در عمل اندازه گیری آن آسان نیست چرا که پروتئین آنتی ژن( اتصال حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت است) .فرضا با انجام چند آزمایش الایزا که دارای pH متفاوت باشند و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش دهی داشته باشند، میتوان اتصال بهتر و مناسبتر پروتئین به پلیت را به دست آورد. پروتئین های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یک pH پائین تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه بین پروتئین و پلیت دارند.

گاهی اوقات بعضی از آنتی ژنها مشکلاتی را در پوششدهی بوجود میآورند؛ این آنتی ژنها شامل پلی ساکاریدها، لیپوپلی ساکاریدها و گلیکولیپیدها هستند که پوشش دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می نمایند. در اینگونه موارد یک‌‌ پوشش دهی ابتدایی موردنیاز است که با یک آنتی سرم اختصاصی انجام می شود که یک حالت ساندویچی را بوجود می آورد، بنابراین مخلوط تخلیص نشده آنتی ژنها، مناسب برای پوشش دهی مستقیم نیست و در صورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده میشود.

به دلیل ماهیت غیرکووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جدا شدن یک پروتئین از پلیت نیز ممکن است رخ دهد، اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد، تأثیر مهمی در یک آزمون الایزا نخواهد گذاشت. انواع روشهای مختلف الایزا عبارتند از ساندویچی، رقابتی و غیررقابتی که در ادامه به آن می پردازیم.